许昌市一体化污水处理设备

不同传统抗菌剂和小分子物质对混合菌生物膜形成的抑制作用

　　为研究不同传统抗菌剂和小分子对生物膜形成的抑制作用, 选择银和氯作为传统抗菌剂, 双(3-氨基丙基)胺、香兰素和BBF作为小分子.首先在12孔板的每个孔内加入3 mL上述制备好的混合菌菌悬液, 混合菌菌悬液中分别含有不同浓度的上述抗菌剂和小分子.其中, Ag+的最终浓度分别为0.01、0.05、0.1、1、10 mg·L-1, 有效氯的最终浓度分别为0.01、0.1、1、10、20 mg·L-1, 双(3-氨基丙基)胺的最终浓度分别为100、500、1000、2000 μmol·L-1, 香兰素的最终浓度分别为0.1、1、10、100、200 mg·L-1, BBF的最终浓度分别为1、10、20 mg·L-1.Ag+、氯、双(3-氨基丙基)胺和香兰素的对照组加入等量的超纯水, BBF的对照组加入等量的纯乙醇.然后将12孔板置于30 ℃的培养箱内静止培养24 h.培养结束后, 将12孔板从培养箱内取出, 上面附着的生物膜量采用结晶紫染色法进行定量, 方法参考Xiong等(2013)的结晶紫染色法：首先将12孔板用PBS溶液冲洗3遍去除上面松散结合的浮游细菌, 然后通过干燥固定上面的生物膜, 生物膜固定后用500 μL、0.1%的结晶紫染色30 min, 然后用PBS将多余的未与生物膜结合的结晶紫洗干净.最后, 用1 mL纯乙醇将与生物膜结合的结晶紫洗脱30 min.取200 μL洗脱液加入到96孔板内通过酶标仪(Tecan Infinite M200, 瑞士)测定OD600.实验组的相对生物膜量为与对照组相比的百分数(对照组为100%).

　　2.3 银和双(3-氨基丙基)胺对混合菌生长曲线的影响

　　为了研究不同浓度的银和双(3-氨基丙基)胺对微生物生长的影响, 将3 mL包含不同浓度的Ag+和双(3-氨基丙基)胺的混合菌菌悬液加入10 mL离心管内, 然后将离心管置于30 ℃、180 r·min-1的条件下培养, 在不同时间内测定悬浮态混合菌的OD600.以往人们采用传统的杀菌/抗菌剂通过杀死微生物细胞来抑制生物膜的形成(夏金兰等, 2004).在这些传统的抗菌剂中, 氯是目前世界上使用最广泛的饮用水消毒剂, 广泛用于饮用水处理和输配系统中(Kim et al., 2009).银离子和纳米银是应用广泛、杀菌效果优异的无机非金属杀菌剂(Rai et al., 2009).然而, 长期使用这些传统杀菌/抑菌剂往往会造成细菌耐药性的增加.

　　近年来有研究发现, 一些信号小分子物质参与生物膜形成与解体过程的调控(张志刚等, 2011).这些小分子通过非杀菌机制抑制生物膜, 因此, 不会产生细菌耐药性的问题.例如, 双(3-氨基丙基)胺能够直接地、特异性地和EPS中的胞外多糖发生反应, 从而抑制生物膜的形成(Si et al., 2014).香兰素通过抑制N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone, AHL, acyl-HSL)来干扰细菌的群体感应(Quorum sensing, QS)系统, 从而抑制生物膜的形成(Ponnusamy et al., 2009).溴代呋喃酮通过和AHLs竞争受体蛋白, 或干扰呋喃酰硼酸二酯(Furan acyl boric acid ester, autoinducer-2, AI-2)来干扰细菌的QS系统, 从而抑制生物膜的形成(Jang et al., 2013; Shetye et al., 2013).

　　目前, 利用传统杀菌剂抑制单一纯菌生物膜形成的研究比较多, 而针对污水处理系统混合菌形成的复杂生物膜, 传统杀菌剂及小分子物质对其抑制效果尚不明确, 有待于深入研究.因此, 本研究选用银和氯作为传统抗菌剂, 选用双(3-氨基丙基)胺、香兰素和(Z-)-4-溴-5-(溴乙烯)-2(5H)-呋喃酮(BBF)作为小分子物质, 比较这些传统抗菌剂和小分子对污水处理系统中混合菌生物膜形成的抑制效应, 筛选效果较好的传统抗菌剂和小分子物质, 并通过测定传统抗菌剂和小分子物质对微生物生长的影响, 分析其抑制混合菌生物膜形成的可能机理, 以期为生物膜污染控制方法提供一定的理论基础.

　　2 材料与方法(Materials and methods)2.1 化学试剂和微生物

　　双(3-氨基丙基)胺和BBF购于Sigma Aldrich (St. Louis, MO), 香兰素购自生工生物工程上海(股份)有限公司.双(3-氨基丙基)胺、香兰素和BBF的化学结构见图 1.双(3-氨基丙基)胺和香兰素溶于超纯水, 实验过程中所用的超纯水(电导率为18.2 MΩ·cm)由Milli-Q梯度系统(Millipore, Bedford, MA)生产.BBF溶于纯乙醇(99%)制得40 mg·L-1的BBF储备液.

　　混合菌取自北京清河污水处理厂的活性污泥.活性污泥首先用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3遍, 然后通过离心(5000 r·min-1)收集, 将收集的活性污泥重悬于配置的模拟废水中, 制备混合菌菌悬液(100 mg·L-1, 大约108 CFU·mL-1).模拟废水成分为(mg·L-1)：COD(以葡萄糖计算) 825, NH4Cl 192, KH2PO4 35.1, NaCl 100, MgSO4 100, CaCl2 10.