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智立中特生物HET-1A人食管上皮细胞复苏说明

发布日期:2022-08-11  浏览次数:1
核心提示:HET-1A细胞系于1986年通过用由RSV-LTR启动子和编码猿猴病毒40大T抗原的序列组成的质粒pRSV-T转染从人食管尸检组织中衍生而来。生长因子研究表明,HET-1A受钙刺激,受胎牛血清、转化生长因子-β1和转化生长因子-β2抑制。
   细胞介绍
 
  HET-1A细胞系于1986年通过用由RSV-LTR启动子和编码猿猴病毒40大T抗原的序列组成的质粒pRSV-T转染从人食管尸检组织中衍生而来。生长因子研究表明,HET-1A受钙刺激,受胎牛血清、转化生长因子-β1和转化生长因子-β2抑制。
 
  伏马菌素B1可抑制HET-1A细胞的生长并增加细胞凋亡。合成类视黄醇CD437(6-[3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基]-2-萘甲酸(AHPN/CD437)0)通过caspase-3依赖途径诱导食管鳞状HET-1A细胞凋亡。细胞核型位亚二倍体(34-40条染色体),可用于研究假定的食道致癌物的作用。
 
  细胞特性
 
  1)来源:黑人男性25岁食管
 
  2)形态:上皮细胞样,贴壁生长
 
  3)含量:>1x106细胞数
 
  4)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装
 
  5)用途:仅供科研使用。
 
  运输和保存
 
  干冰运输及复苏好存活细胞
 
  (1)1mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。
 
  (2)T25瓶复苏的存活细胞常温发货,收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
 
  细胞接收后的处理
 
  1)收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们。
 
  2)请在4或5X显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据。
 
  3)贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
 
  4)备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后**次传代建议T25培养瓶1:2传代。
 
  细胞培养步骤
 
  一.培养基及培养冻存条件准备:
 
  1)准备BEGMkit培养基备注:培养基包含(A+B)
 
  A:BEBM基础培养基500ML
 
  B:细胞生长添加剂一套(包含下列试剂)
 
  ●BPE,2.0ml●Hydrocortisone,0.5ml●hEGF,0.5ml
 
  ●Epinephrine,0.5ml●Insulin,0.5ml●Transferrin,0.5ml
 
  ●Triiodothyronine,0.5ml●RetinoicAcid,0.5ml●GA,0.5ml
 
  ATCC不使用BEGM试剂盒提供的GA-1000(庆大霉素-两性霉素B混合物)。
 
  P/S青霉素-链霉素5ml
 
  注意:不要过滤完全培养基。
 
  2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
 
  3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
 
  二.细胞处理:
 
  1)冻存细胞的复苏:
 
  将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。*二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
 
  2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
 
  对于贴壁细胞传代可以参考以下方法:
 
  1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
 
  2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
 
  3.轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
 
  3)细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
 
  下面T25瓶为例;
 
  1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中,可使用血球计数板计数,来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
 
  2.1000rpm离心3-5min,去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞,按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。
 
  3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80度冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
 
 
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